本發明涉及一種通過CRISPR/Cas9系統快速獲得大片段缺失的細胞系基因敲除方法,屬于基因工程和遺傳修飾領域。本發明改造pX458載體,使其帶有DsRed2和ECFP,然后針對目標基因設計多個特異性的sgRNA位點,將其連接至改造載體中,轉染細胞系后利用流式細胞儀對細胞群進行分選,可以非常快速獲得基因組被編輯的單細胞,然后用PCR擴增單細胞DNA序列,通過凝膠電泳即可以從中挑選出具有大片段缺失的單細胞。本發明通過將CRISPR/Cas9系統、流式細胞儀單細胞分選和表達載體上的熒光蛋白篩選三者結合起來,可以在短時間內獲得具有大片段缺失的陽性單克隆,極大地提高細胞系基因敲除工作效率。
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